安宫牛黄丸为我国传统复方中药中享有盛名的急症用药［1］，是临床中治疗高热症的“温病三宝”之一，于清代温病学家吴鞠通的温病条辨中首次被记载，功效解毒清热、芳香醒神、豁痰开窍，主治邪热内陷、高热不退及神昏谵语等热证。卒中、高热昏迷、脑炎、脑出血及癫痫为其典型临床适应证［2］。

　　安宫牛黄丸为《中国药典》 2020 年版收录方剂，其质量控制采用高效液相色谱法限定胆红素、黄芩苷及盐酸小檗碱的含量［ 3 ］ 。但该方由多味药组成，药味配伍关系和成分较为复杂，饮片质量也参差不齐，且现有的质量控制标准不高；因此，建立能够全面阐述复方质量特点的方法具有重大意义。中药质量标志物（ Q-Marker ）于 2016 年由刘昌孝院士提出，此概念是指将中药药效 - 活性成分 - 质量控制标志物成分相关联，为中药质量控制标准的整体性建立开拓新思想［ 4 ］ 。本研究通过网络药理学方法筛选安宫牛黄丸关键活性成分，并结合超高效液相色谱（ UPLC ）建立指纹图谱，预测其潜在 Q-Marker 。旨在为安宫牛黄丸的全面质控提供依据，为其作用机制研究提供参考，也为其他中药复方预测 Q-Marker 提供新的思路。

　　安宫牛黄丸（批号： 3792005003 、 812011001 、 3792008004 、 3792011007 、 3792009006 、 3792008005 、 3842104002 、 3782011002 、 3772009004 、 3842104001 ，对应编号为 S1 ～ S10 ，山西广誉远国药集团有限公司）；复方中冰片等 11 味单味药材均由山西广誉远国药集团有限公司提供，经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为牛黄、水牛角、人工麝香、珍珠、朱砂、雄黄、黄连、黄芩、栀子、郁金、冰片，均符合《中国药典》 2020 年版要求，留样于山西大学中医药现代研究中心；超纯水（自制）；甲醇（分析纯，天津大茂化学试剂厂）；乙腈、甲酸（质谱级，美国赛默飞世尔科技公司）。

　　2.1.1安宫牛黄丸活性成分及靶点的收集 利用 TCMSP 检索并收集冰片、黄连、黄芩、牛黄、郁金、栀子 6 味中药活性成分，得到活性成分后筛选，以口服生物利用度（ OB ） ≥ 30% 与类药性指数（ DL ） ≥ 0.18 标准［ 5-6 ］ 进行成分筛选。安宫牛黄丸中矿物药及动物药如珍珠、水牛角、雄黄、朱砂、麝香在 TCMSP 数据库中无相关资料，经查阅文献报道［ 7-10 ］ ，收集活性成分及相应的 CAS 号，检索 PubChem 数据库，得到相关成分的 sfd 格式的 2 维结构图，将信息导入 SwissADME 数据库，以胃肠道吸收结果为 High 、 5 类类药性结果至少 2 个是 Yes 为标准，筛选出易成药、易于吸收的活性成分。将得到的活性成分导入 SwissTargetPrediction 数据库收集对应的靶点，应用 UniProt 数据库，注释与校正得到的靶点基因，物种选择为“ human ”。

　　2.1.2安宫牛黄丸临床适应证疾病共有靶点的收集 查询 GeneCards 数据库，并收集热证疾病靶点，本研究选择卒中、高热昏迷、脑炎、脑出血及癫痫等临床适应证以关键词“ stroke ”“ hyperthermic coma ”“ encephalitis ”“ cerebral hemorrhage ”“ epilepsy ”进行检索并筛选，筛选标准为相关分数（ relevance score ） ≥ 10.00 。运用 R×64 4.2.0 软件将上述查询到的疾病靶点取交集后，再与候选活性成分所对应的靶点取交集，以获取安宫牛黄丸发挥疗效的潜在作用靶点。应用 UniProt 数据库，注释与校正得到的潜在作用靶点，物种选择为“ human ”，并删除重复值。

　　2.1.3“药材 - 活性成分 - 共有靶点”网络构建与分析 利用 Cytoscape 软件（ 3.8.0 版）构建“药材 - 活性成分 - 共有靶点”网络，并应用 Analyzer 工具计算网络拓扑参数，以度（ degree ） ≥ 10 倍中位数为筛选条件，数值越大，成为安宫牛黄丸发挥药效的关键活性成分可能性越大。

　　2.1.4关键靶点及关键活性成分的确定 将“ 2.1.2 ”项获得的交集靶点导入 STRING 数据库，去除离散或无关联的基因节点，筛选标准为置信值（ medium confidence ）＝ 0.9 ，得到蛋白质相互作用（ PPI ）网络。利用 Cytoscape 3.8.0 软件分析得到的 PPI 网络，以度值、介数和接近中心性参数为条件筛选排名靠前的关键靶点。根据“ 2.1.3 ”项获得的活性成分与关键靶点的连接度值，筛选密切程度高的关键活性成分。

　　2.1.5交集靶点的基因本体（ GO ）注释及京都基因与基因组百科全书（ KEGG ）通路富集分析 利用 DAVID 数据库对交集靶点进行 KEGG 通路分析和 GO 分析，选择智人（ Homo Sapiens ）为条件。

　　2.2.1供试品溶液制备 取不同批次安宫牛黄丸大蜜丸，剪碎，研磨混合，精密称定 0.5 g ，转移至锥形瓶中精密加入 75% 甲醇 25 mL ， 30 ℃ 超声提取 30 min ，提取液滤过，旋转蒸发仪蒸干溶剂后，加入甲醇定容至 10 mL ，静置，补重，摇匀，取上清液滤过（ 0.22 μm 微孔滤膜），取续滤液，即得。

　　2.2.2各药材供试品溶液制备 取复方组方药材各 0.1 g （过 40 目筛），分别置于 50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入 75% 甲醇 50 mL ，密塞， 30 ℃ 超声处理 30 min ，放至室温，摇匀，静置，用 75% 甲醇补重，取上清液滤过（ 0.22 μm 微孔滤膜），取续滤液，即得。

　　（ 1 ）精密度考察：取安宫牛黄丸（批号： 3792005003 ） 1 份，按照“ 2.2.1 ”项下方法制得供试品溶液，按“ 2.2.3 ”项下色谱条件在 UPLC 色谱仪中连续进样 6 次，记录色谱图，计算共有峰的峰面积和保留时间的 RSD 值。

　　（ 2 ）重复性考察：取安宫牛黄丸（批号： 3792005003 ） 1 份，按照“ 2.2.1 ”项下的方法平行制备供试品溶液 6 份，按照“ 2.2.3 ”项下色谱条件进样，记录色谱图，计算共有峰的峰面积和保留时间的 RSD 值。

　　（ 3 ）稳定性考察：取安宫牛黄丸（批号： 3792005003 ） 1 份，按照“ 2.2.1 ”项下的方法制得供试品溶液，分别于 0 、 2 、 4 、 8 、 12 、 24 h 按照“ 2.2.3 ”项下色谱条件进样，记录色谱图，计算共有峰的峰面积和保留时间的 RSD 值。

　　2.2.5安宫牛黄丸指纹图谱共有峰的归属及指认 取 10 批安宫牛黄丸各 1 份，并取安宫牛黄丸中 11 种单味药材，分别按照“ 2.2.1 ”和“ 2.2.2 ”项下的方法制备供试品溶液和各单味药材供试品溶液，按照“ 2.2.3 ”项下色谱条件进样，得到 10 批安宫牛黄丸指纹图谱叠加图。选择图谱中含量较大且分离度较好的色谱峰作为共有峰。收集安宫牛黄丸和各单味药材指纹图谱，通过比较色谱峰的色谱保留行为对共有峰的药材来源进行归属。根据文献报道［ 11-12 ］ ，对指纹图谱有峰进行指认。

　　2.2.6安宫牛黄丸指纹图谱相似度评价 分别取 10 批次安宫牛黄丸样品，按照“ 2.2.1 ”项下的方法制备供试品溶液，按照“ 2.2.3 ”项下色谱条件进样，记录色谱图。将色谱图数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（ 2012.130723 版）并分析，其中 S6 批次的色谱图的色谱峰峰形和分离度较好，且基线平稳，故选择该批次色谱图作为对照图谱。相似度评价方法选择平均数法，避免极端数据对结果的影响［ 13 ］ 。对色谱峰的全谱峰分析采用多点校。

　　将网络药理学筛选得到的关键活性成分及指纹图谱确定的关键成分的交集成分初步确定为潜在 Q-Marker ，利用 Auto Dock Vina 软件对相关成分与关键核心靶点进行分子对接，验证其相互作用活性。从 PubChem （ https ： //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ）数据库下载 Q-Marker （配体）结构的 mol2 格式， PDB 数据库（ http ： //）获取关键靶点（受体）对应的蛋白三维结构 pdb 格式。使用 AutoDock 软件对配体进行判断 root 等，对受体设定原子类型等，并分别将配体及受体格式转换为 pdbqt 格式，再进行对接并获取结合能计算结果，使用 PyMOL 软件对成分 - 蛋白对接结果进行可视化分析。

　　3.1.1安宫牛黄丸活性成分及临床适应证疾病靶点 经 TCMSP 检索并筛选后，得到活性成分 88 个，其中冰片 3 个、黄连 14 个、黄芩 36 个、牛黄 5 个、郁金 15 个和栀子 15 个。经查阅相关文献收集水牛角、麝香、雄黄、朱砂、珍珠化学成分，并导入 SWISS ADME 数据库，以类药性和胃肠道吸收为条件筛选，得到可以成药、可以被吸收的化学成分共 40 个，其中水牛角 7 个、麝香 22 个、珍珠 11 个。综合共得到 128 个候选活性成分。将 128 个候选活性成分导入数据库中检索对应靶点，去重后共得到 613 个成分相关靶点。

　　通过 GeneCards 数据库共得到适应证疾病交集靶点 938 个，见图 1-A 。取上述靶点与候选活性成分靶点取交集，得到安宫牛黄丸治疗卒中、高热昏迷、脑炎、脑出血及癫痫的共有疾病靶点 131 个，包含 AKT1 、 VEGFA 、 BCL2 等靶点，见图 1-B 。

　　3.1.2“药材 - 活性成分 - 共有靶点”网络分析 利用 Cytoscape 软件（ 3.8.0 版）构建“药材 - 活性成分 - 共有靶点”网络，得到安宫牛黄丸治疗卒中、高热昏迷、脑炎、脑出血、肝性脑病及癫痫的“药材 - 活性成分 - 共有靶点”网络图，见图 2 。结果显示，槲皮素（ degree ＝ 32 ）、 β- 谷甾醇（ degree ＝ 18 ）、麝香酮（ degree ＝ 16 ）、黄芩素（ degree ＝ 14 ）、小檗碱（ degree ＝ 14 ）、熊果酸（ degree ＝ 12 ）、异亮氨酸（ degree ＝ 10 ）及汉黄芩素（ degree ＝ 10 ）等成分与各靶点连接度较高。

　　3.1.3关键靶点及关键活性成分确定 将获得的交集靶点 131 个导入 STRING 数据库，得到 PPI 网络，见图 3 。以度值、介数和接近中心性参数为条件筛选排名靠前的关键靶点。得到排名前 10 的靶。